仪器仪表：光学显微镜

利用可见光(380～760纳米波长)照明?使微小物体放大成像的仪器。这种放大像可用肉眼观察?摄影或用光电管以及其它接受器进行探测。

(见彩图 19世纪中期的显微镜

带自动照相机的光学显微镜

装有场发射枪的扫描电子显微镜?分辨率为20A

超高压透射电子显微镜?加速电压可达2000kV

R.虎克在17世纪中期制做的复式显微镜

20世纪初期的显微镜?数值孔径达1.4 )
基本结构 可分为简单和复式两种类型。简单显微镜即放大镜?由正透镜组成?放置于物体和肉眼之间?使微小物体放大成虚像。复式显微镜由两组透镜或透镜系统组成。第一组透镜(即物镜)形成物体的放大像?第二组透镜(即目镜)放大第一组透镜形成的像。典型的复式光学显微镜由支架?反光镜?聚光镜?载物台?镜筒?物镜?目镜?以及调节镜筒或载物台移动的机械装置组成 (图1 复式光学显微镜 )。反光镜的作用是使光线通过反射面进入仪器?载物台下的聚光镜?可增强对样品的照明能力?物镜在镜筒中形成一个中间的实象?目镜则放大中间像?在接近样品平面处形成一个虚像(当用肉眼观察时)?或在目镜上方的照相底片平面上形成一个实象。
性能 除了能放大物体外?还应具有良好的分辨力以及形成好的反差像。
分辨力 指能够分辨出两个相距最近的物点的能力。可由下式表示?
两物点的最小分辨距离＝
λ为成像光线的波长? 为样品周围介质的折射率?是进入物镜光锥的半角?为常数-约在 0.61～1.0之间??sin 为物镜的数值孔径(常用N.A.表示)?用于测定物镜的分辨力。数值孔径越大?能够分辨出二物点之间的距离则越小?因而分辨力就越强。光学显微镜的最小分辨距离为 0.2微米?如果小于这个距离就不能分辨。
反差 表明样品各部分之间以及它们与背景之间光亮度的差别。在一般明视场显微镜中?样品各部分对光的吸收不同?这是造成反差的主要原因。此外?样品表面上的散射对形成反差也很重要。在适当的情况下?缩小聚光镜的孔径光阑虽会减小显微镜的分辨力?但增强了反差?反而会使图像更清晰可辨。许多特殊显微镜正是基于增强样品的反差设计的。
透镜的像差 除了分辨力的限制以外?透镜本身存在着一系列缺陷?影响显微镜成像的质量。这些缺陷名为像差?包括由于透镜边缘和中央部分的折射不同造成的球差?由于不同波长的光线折射率不同造成的色差以及场曲等。用组合透镜可以纠正一定程度的像差。
主要部件与功能 物镜 其作用是形成第一级像。在物镜上一般都标出数值孔径?放大率?焦距长度和工作距离等有关数值。一般对物镜的球差都进行了校正?对两种颜色(蓝和红)色差进行了校正的物镜称为消色差物镜?校正3种颜色(蓝?绿和红)色差的称为复消色差物镜?居于二者之间的称为半-复消色差物镜。平场物镜纠正了场曲?适用于显微摄影。浸液物镜(浸油?水或其它化合物)可以增加数值孔径?提高物镜的分辨力。荧光显微镜中常用40倍或 60倍数值孔径为 1.30的浸液物镜?以增强收集荧光的能力。通常的物镜适用于0.17毫米厚度的盖玻片?但实际上盖玻片的厚度变动于0.15～0.22毫米之间?易造成像差?因而有些物镜上装置了“校正环”用来补偿盖玻片厚度的变化。
目镜 用于放大物镜形成的中间像?也用于校正中间像中的残余像差。
目镜有 5～20倍的放大倍数。惠更斯目镜是最常用的一种目镜。补偿目镜是与复消色差物镜组合使用的?以补偿复消色差物镜的放大率色差。为了保持最小畸变的平面场?设计了投影或摄影目镜?用于显微投影或摄影。长出瞳目镜适用于戴眼镜者观看。广视场目镜可观察到较大的现场。
镜筒 分为单目?双目?三目 3种。三目镜筒的两个目镜用于观察?另一个用于显微摄影?投影或测量。
聚光镜和照明 聚光镜用于集中从光源来的光线?使被观察的标本得到更明亮和均匀的照明。常用的有阿贝聚光镜?由两个透镜组成?数值孔径为1.30?通常带有球差和色差。多透镜的聚光镜可校正这些误差?其数值孔径可达1.40。正确使用聚光镜系统对于发挥显微镜的分辨力和增强像的反差有很大的影响。常用的照明系统有两种?一为临界照明?使光源聚焦在样品平面上?另一种为柯勒照明?即通过灯室透镜在聚光镜孔径光阑上形成光源的像?此外在标本平面上形成视场光阑的像。柯勒照相能得到均匀的照明?并得到好的反差像。照明可用日光或人工光。
几种特殊类型的光学显微镜 暗视场显微镜 使用特殊的暗视场聚光镜使照明光线偏移而不进入物镜?只有样品的散射光进入物镜。因而在暗背景上得到亮的像(图2c 人口腔上皮细胞显微摄影图像 )?与暗视场照明相反?照明的光线直接到达成像平面的?称明视场照明。
暗视场显微镜主要用于观察结构和折射率变化有关的物体?如硅藻?放射虫类?细菌等具有规律结构的单细胞生物以及细胞中的线状结构?如鞭毛?纤维等。用暗视场显微镜还可观察到物镜分辨极限以下的质点?但不适用于观察染色的标本。
相差显微镜 利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别?把通过物体不同部分的光程差转变为振幅(光强度)的差别(图2b 人口腔上皮细胞显微摄影图像 )?经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测的显微镜。主要用于观察活细胞或不染色的组织切片?有时也可用于观察缺少反差的染色样品。
干涉显微镜 采用通过样品内和样品外的相干光束产生干涉的方法?把相位差(或光程差)转换为振幅(光强度)变化的显微镜?根据干涉图形可分辨出样品中的结构(图2f 人口腔上皮细胞显微摄影图像 )?并可测定样品中一定区域内的相位差或光程差。由于分开光束的方法不同?有不同类型的干涉显微镜?以及用于测定非均匀样品的积分显微镜干涉仪。
干涉显微镜主要用于测定活的或未固定的相互分散的细胞或组织的厚度或折射率。
微分干涉差显微镜 一种特殊形式的干涉显微镜?只是其相干光束分开的距离相当小?仅为1微米?有时还小于物镜的最小分辨距离?因而二束相干光都通过样品?可观察到样品中光程差的局部差异(梯度)。
微分干涉差显微镜用于观察活的或未染色的样品的精细结构?产生一种带颜色的如浮雕般的反差像(图2d 人口腔上皮细胞显微摄影图像 )但不能用于定量测定。
荧光显微镜 用激发光照射样品?根据样品产生的荧光进行观察的显微镜(图2e 人口腔上皮细胞显微摄影图像 )。生物学?医学中应用的荧光有自发荧光?诱发荧光(包括或化学诱发)?荧光着色?免疫荧光等。荧光显微镜激发光照射的方式?有透射和落射两种。
偏光显微镜 用于观察双折射样品的显微镜。绝大多数结构有规则的生物体系的折射率因光波传播方向而异?一般称为双折射体系?有分子(晶体)双折射?形式双折射?应力双折射或几种类型兼而有之。偏光显微镜的主要组成是在一般显微镜的光源和聚光镜之间放置一个起偏(振)镜?在物镜和目镜之间放置一个检偏(振)镜?并采用旋转载物台。调节起?检偏振镜的主截面使之互相垂直(正交位置)?使在暗背景上显出双折射样品的明亮像。此外?利用各种补色器可以定量测定双折射的程度?进而推算出分子或颗粒在样品中排列的方向。近有用远红外线作光源的显微镜?由于波长不受水的干扰?反差也好?不用染色即可观察活体。另外?还有利用紫外线做光源的显微镜?它用反射光学或特殊的晶体透镜系统。
显微镜可根据不同用途对各种结构作适当的改变?形成许多其它类型。如比较显微镜?倒置显微镜?解剖体视显微镜?毛细管显微镜以及离心显微镜等。
近年来在光学显微术的重大进展是共焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microcope?CLSM)的应用?它大大的提高了影像的反差和分辨力。由于只使物镜焦面上的样品成像?所以可对样品进行“光切片”?并通过计算器样品影像进行三维重组。
参考书目
谷祝平:《光学显微镜》?甘肃人民出版社?兰州?1985。